肺癌在全世界的发病率和病死率居高不下，近年来更是一跃成为中国最常见的死亡原因。由于缺乏理想的早期诊断方法，且肺癌患者在发病早期的临床症状不明显，导致肺癌确诊时已发病至中晚期，使患者错过了最佳的治疗时期。因此，肺癌的早期诊断是降低肺癌患者病死率的关键。近年来，随着循环肿瘤细胞(CTCs)检测技术的发展，特别是CellSearch系统在临床实践中的广泛应用，CTCs检测将成为对肿瘤早期诊断、治疗及预后评估的新型工具。本文综述近年来CTCs检测诊断技术的进展及其在肺癌诊断中的应用，并对其检测技术面临的挑战进行探讨。
CTCs检测技术的进展
1869年，ASHWORTH在肿瘤患者的血液中检测到CTCs，并且发现在肿瘤发生早期即有CTCs通过血液循环发生全身扩散的现象，这一发现开启了国内外多个国家医学专家的研究热潮。CTCs进入血液循环后通过迁移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶，CTCs在肿瘤的发生发展和转移扩散中均扮演着重要角色。
1.1 CTCs的富集
CTCs在外周血中的浓度极低，出现的概率约为每109个血细胞中出现1个CTCs，所以，CTCs检测的关键在于能否在复杂环境中准确、高速有效地富集CTCs。根据检测原理，CTCs的富集方法可分为特异性富集方法和非特异性富集方法。特异性富集方法基于CTCs细胞表面的标志物如细胞角蛋白(CK)等进行富集，包括免疫磁性分离法(IMS)、芯片富集法、纳米粒富集法等。其中IMS是目前用于富集CTCs最常见的方法，它的原理是在外部磁场中，相应的抗原抗体复合物附着在磁珠上并保留在磁场中，而没有这种表面抗原的其他细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单克隆抗体结合而不具有磁性，不在磁场中停留，从而使肿瘤细胞得以分离。非特异性富集方法是根据CTCs自身的物理特性，如大小、密度等进行富集，包括密度梯度离心法、细胞大小富集法等。密度梯度离心法是目前实验室常用的一种基于形态学特点富集肿瘤细胞的方法，该方法设备要求低，操作简便，但该方法血液需求量大，灵敏度低，重复性较差。
1.2 CTCs的检测
根据检测原理，富集CTCs检测方法可分2大类：细胞计数法和核酸检测法。前者主要包括各种免疫细胞化学技术(ICC)、流式细胞术(FCM)等，后者主要包括PCR、逆转录PCR等技术。
1.2.1 ICC
ICC指以显色剂标记的特异性抗体与CTCs特异性结合后，通过显色剂显色反应对相应抗原进行定位、定性和定量测定的技术。ICC检测能够对细胞大小和形态进行分析，但灵敏度低，只能从(1～10)×105个正常细胞中发现1个肿瘤细胞，这无疑限制了其在临床上的应用。
1.2.2 FCM
该方法集激光、电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学及单克隆抗体技术为一体，能够对细胞和亚细胞结构进行检测的方法。近年来有一种微创体内检测技术，通过将荧光标记的单克隆抗体注射入体内，通过放置于血管的激光检测流过的CTCs，极大地弥补了检测灵敏度的不足。
1.2.3 PCR
该方法主要通过检测癌基因、抑癌基因的突变或染色体质量产生的异常DNA来检测肿瘤患者外周血中的CTCs。
1.2.4 逆转录PCR
该方法是在PCR的基础上扩增由肿瘤特异性mRNA序列逆转录的DNA片段，由于这些特异性的mRNA通常不表达于正常外周血细胞，因此，在某些基因改变后，可以基于组织或肿瘤特异性mRNA的表达或某些基因改变后RNA水平的异常可以间接检测到CTCs的存在。此法灵敏度较高，但是假阳性率高，无法检测CTCs细胞形态等问题局限了该方法在临床上的应用。随着近几年逆转录PCR技术的发展，实时定量逆转录PCR、荧光定量逆转录PCR等新方法的出现，由于其高扩增效率和高特异度、灵敏度，逆转录PCR及其改进技术广泛应用于CTCs的检测中，被公认为目前最准确的检测方法。
1.2.5 富集与检测技术结合
为了加速CTCs检测在临床实践中的应用，近年来，结合富集和检测技术的自动化检测系统已被用于提高检测的灵敏度和特异度。目前，CellSearch检测系统相对成熟并得到广泛应用。CellSearch系统是一个使用灵活，功能强大的研究平台。
CellSearch检测系统首先通过纳米磁珠特异性地富集血液中的CTCs。再进一步将富集出来的CTCs进行化学或生物染色，最后通过检测系统完成对CTCs的准确检测。该系统具有特异度、灵敏度、重复性高的优点，可从400多亿的血细胞中检测到单一的一个CTCs，并且检测结果准确可靠。值得注意的是，使用单一抗原富集CTCs(如表面的EpCAM)经常导致检测结果中的假阴性，因为并非每种肿瘤细胞都表达上皮标志。为了避免这一问题的出现，研究者开始加入新的表面分子。使用抗EpCAM和抗CK(CK7/8)的免疫磁珠富集CTCs，用酶学方法去检测CTCs。OncoCEE平台运用了多种混合抗体富集转移性乳腺癌患者的CTCs，与CellSearch相比，灵敏度提高了21%。虽然使用新的检测标志物可以提高检出率，但同时会增加与正常有核细胞的特异和非特异性反应，因此，只有筛选出具有强特异度的标志物才可以提高CTCs的检出率。此外，具有高灵敏度的CTCs-Chip也是一项集富集与检测为一体的先进技术，即使只有极少量的肿瘤细胞，CTCs-Chip技术也可以一步将它们于全血中捕获，捕获的肿瘤细胞存活率高达98%，并且检测结果不受肿瘤细胞间歇性释放的影响。鉴于肺癌影像学筛查的效用和成本争议，CTCs-Chip的血液检测作为吸烟者等肺癌高危人群的筛查工具极具吸引力。
2.CTCs在肺癌中的应用
肺癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤，肺癌患者的5年生存率低于15%，其中非小细胞肺癌占肺癌患者总数的80%～85%。近年来，基于血液中生物标志物的液体活检技术为肺癌的早期诊断与早期转移复发的检测提供了新思路，这些生物标志物包括循环肿瘤DNA(ctDNA)和CTCs。ctDNA主要是指来自肿瘤细胞坏死凋亡后释放于人体血液系统中不断循环的肿瘤基因组游离DNA片段。CHAN等通过对比肺癌患者与健康人的ctDNA含量的显著差异，证明通过检测ctDNA含量的变化，可以对肺癌高危人群进行早期筛查。相较于ctDNA检测，CTCs检测具有独特优势，通过检测从实体肿瘤上脱落后进入血液循环的肿瘤细胞，对转移癌的诊断具有极高的特异度，能够鉴定所有类型的肿瘤细胞，并且能进一步进行肿瘤分子生物学和遗传学分析。
研究发现，进入人体循环系统的CTCs绝大多数被机体的免疫系统杀伤或在血液动力学的作用下破坏死亡，只有少数能存活下来，并在一定条件下发展为转移灶，而外周血中CTCs的数量反映了肺癌发生血行转移的程度和能力，CTCs计数会随着肿瘤远处转移的进展而显著增高。此外，CTCs在肺癌的早期诊断、微转移、评估疗效与预后、选择合适的个体化治疗等方面的作用也得到了大量的研究证实。LV等使用CellSearch系统检测32例非小细胞肺癌患者肺静脉血中的CTCs，结果显示阳性率为90.6%(29/32)，且CTCs计数与肿瘤大小呈正相关(P=0.012)，后将来自3例患者的富集的CTCs注射到3只免疫缺陷小的小鼠中，1只小鼠产生异种移植肿瘤，表明CTCs检测有助于早期发现肺癌及可能出现的微转移。LOU等使用定量PCR和免疫细胞化学法检测各阶段肺癌患者的外周血CTCs，结果显示阳性率为70%，研究结果同时表明，CTCs阳性率与血清肿瘤标志物(包括血清癌胚抗原、细胞角蛋白片段19抗原21-1)升高的水平无关，但与肺癌的临床分期有关，其中Ⅰ期肺癌的阳性率为67.2%，CTCs对肺癌的早期诊断更为灵敏。FIORELLI等应用细胞大小富集法从77例患有恶性(n=60)和良性(n=17)肺病变的患者外周血中分析CTCs，统计数据表明，60例(90%)恶性肿瘤患者中有54例检测出CTCs，17例(5%)良性患者中有1例检测出CTCs，在测试的Ⅰ期肺癌患者(42%)中，CTCs的数量与肿瘤大小相关(P=0.001)。另一项研究数据表明，CTCs在肺癌早期即可检测到，阳性率为68%，表明CTCs检测有助于早期发现肺癌及可能出现的微转移。PUNNOOSE等通过CellSearch法检测41例非小细胞肺癌患者的CTCs，发现CTCs计数的降低与放射性治疗具有相关性，表明CTCs检测可作为肺癌患者放射性治疗后的检测手段。MAHESWARAN等采用CTCs-Chip法检测27例非小细胞肺癌患者的CTCs，结果显示，从接受酪氨酸激酶抑制剂治疗的EGFR突变患者中收集的CTCs中检测到T790M突变(该突变赋予药物抗性)，表明CTCs检测可作为肺癌患者靶向药物治疗后检测治疗期间基因型变化的方法。BREITENBUECHER等研究表明，携带EGFR突变的肺癌患者中有84%的CTCs可检测到EGFR突变，在94%的病例中，CTCs中发现的突变与肿瘤组织中的突变不一致，这可能是由于原发病灶和转移部位之间的肿瘤异质性导致。TANIGUCHI等采用逆转录PCR法检测8例肺癌患者的CTCs，结果显示EGFR突变患者在CTCs中均表现出相同的突变。此外，CTCs在其他肿瘤的临床应用方面也取得了一些进展，如胰腺癌、胃癌、膀胱癌。
CTCs检测是一种真正的无创、可以动态监测病情变化、对于肿瘤的早期诊断、复发与转移、靶向药物筛选等具有重要临床意义的检测方法，在恶性肿瘤精准医疗领域具有良好的临床应用前景和巨大的社会效益。但目前尚缺乏规范的检测流程与相应的质量标准，还需进一步的临床试验去完善检测的重复性。各种富集和检测新方法的联合使用也将极大地提高检测的灵敏度和特异度，随着技术的不断改进与发展，CTCs检测必将在临床肿瘤诊治中得到推广应用。
